PCR使用的Taq酶應(yīng)該注意如下問題

為彌補taq酶這一缺點常將克隆后的序列進(jìn)行測序，來確認(rèn)所擴增序列的準(zhǔn)確性。同時也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，來確保擴增的準(zhǔn)確性，Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯率Z低的。但PCR產(chǎn)物為平端，不能進(jìn)行Ta克隆！而解決此問題的辦法是使用TaqPlus DNAPolymerase，該酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保證準(zhǔn)確性又能保證能夠進(jìn)行Ta克隆。在使用中應(yīng)該注意如下問題：

1．25ul體系中一般用量為0.1ul（用槍頭沾一下即可），用量過多可能會出現(xiàn)非特異性擴增。

2.PCR體系構(gòu)建過程中Z后加入的一種成分，因此只有在其他試劑加完之后才可從冰箱中取出加入。

3.Taq酶中含有甘油，故不結(jié)冰，若結(jié)冰則應(yīng)丟棄。

4.對于預(yù)變性時間較長的PCR反應(yīng)，應(yīng)在預(yù)變性即將結(jié)束后加入酶，減少長時間高溫對酶活力造成的損傷。

5.保存時間過長的酶可以適當(dāng)增加用量。

PCR使用的taq酶在反應(yīng)時由于喪失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反應(yīng)中，taq酶造成的錯誤的核苷酸錯誤的摻入率大概為每20000個核苷酸中就有一個，雖然表面上看起來不會有多大的影響，但是在分子克隆中如果有一個錯誤核苷酸摻入，很有可能造成移碼突變，影響是嚴(yán)重的